基于基因編輯質粒的相關問題討論

1、

Q:利用crsipr敲除，可以用瞬轉質粒嘛？

A:可以！這樣做得到的細胞是mosaic，即有的細胞是基因組編輯了，有的則沒有；有的細胞基因敲除了，有點則沒有。如果只要改變部分細胞基因即可的話，則可以通過瞬轉，如以原代細胞為研究對象。

 

2、

Q:保存領到的質粒和菌液，說明書上說質粒保存溫度-20℃/-80℃，怎么決定？我把領到的裝質粒和菌液的離心管插到一個管插上直接放進-80℃冰箱可以嗎？

A:在兩個溫度下都可以保存，但請注意，質粒可保存的時間較短（1～2年）。建議將相應的細菌加甘油，可在-80℃下長久保存。細菌需要加冷凍保護劑甘油才能凍存到-80℃冰箱中，質粒直接放入。

 

3、

Q:我想把CRISPR-Cas9質粒的flag標簽直接替換成GFP標簽，是不是可以直接對FLAG標簽附近的酶切位點進行雙酶切就可以了？謝謝！

A:FLAG附近沒有可以直接用于酶切的酶切位點。

 

4、

Q:請問可以用cas9技術對腺病毒骨架質粒進行編輯嗎？

A:可以。

Q:在真核細胞還是原核細胞里好改造？

A:多大的質粒？一般改造質粒在體外用常規的分子操作即可。

Q:轉過質粒后用puro篩選細胞，細胞傳了幾代不怎么死了，請問是剩下的這些細胞都是轉進了質粒呢還是傳代對細胞有影響，還是相當于只用藥篩了一個生長周期？

A:有可能是抗生素濃度過大造成的，如果質粒表達熒光蛋白可以鏡檢一下，不過傳代次數多了熒光也會減弱。

 

5、

Q:我這邊用咱們的質粒做了個敲除實驗，結果很不錯，現在我對敲入很感興趣，想問一下定點敲入的話，供體質粒怎么選擇？

A:供體的設計取決于期望敲入DNA片段的情況。

 

6、

Q:cas9質粒轉染細胞后需要做CruiserTM酶篩選陽性克隆嗎？是不是也需要確定一下基因敲除的效率約為多少呢？

A:我們建議的策略是直接測序，不建議酶切，因為直接測序結果更明確，性價比更高（可避免假陽性結果），對于酶切，我們沒有成功經驗。

 

7、

Q:我想驗證質粒是否已整合到基因組上，想設計一對puro的引物，然后去基因組上擴增，首先想拿質粒上的這段puro基因去NCBI中先比對一下，我是應該和pac基因的序列比對嗎？

A:你所說的pac基因是什么意思？GenBank上應該可以找到puro的編碼序列。上ncbi網頁，將pcr產物的測序結果直接比對（BLAST）就可以。

Q:我拿質粒上的puro序列和puro的全序列進行了比對，發現在1650bp處的堿基發生了替換，這對puro的抗性會有影響嗎

A:看看是否為同義突變？一般不會有問題。

 

8、

Q:我想用Crispr構建一個基因敲除的慢病毒載體，在細胞里做loss of function，公司說評估了一下我們的基因，回復sgRNA評分很低，沒辦法三保一，我想問一下，在sgRNA評分低的情況下，這個基因還能不能做？

A:已有的軟件給出的sgRNA活性評價都是基于有限的實驗數據，對未知的sgRNA活性推測只能具有參考意義。鑒于慢病毒包裝比較貴，而制備All-in-One的sgRNA表達質粒要便宜很多，因此建議首先在細胞系上（同物種，轉染效率高）先進行sgRNA活性檢測，以篩選到有活性的sgRNA。一旦篩選到有活性的sgRNA，未來只要包裝一個有活性的sgRNA表達載體/Cas9表達載體的慢病毒即可。

 

9、

Q:我想請教一個問題，我們用cas9工具慢病毒敲除一個A基因后，想再把帶有一個突變位點的A基因（帶有突變A基因的載體是質粒）插入基因組內，可以請教一下轉染了慢病毒之后多久之后轉染質粒，這個突變基因插入基因組內的成功率會比較高呢？

A:工作對象是原代細胞還是細胞系？

Q:細胞系。

A:那么質粒轉染沒有問題了。不過，有一個問題，含突變位點的A基因是否會被病毒攜帶的基因組編輯工具所識別，如果是，成功重組的表達質粒中的A基因會被基因組編輯工具所編輯，就有可能實現不了你的目標。敲除可以考慮直接用質粒瞬轉，敲入使用慢病毒，這樣更合理。

 

10、

Q:是否能將sgRNA單鏈序列（20+60）和Cas9蛋白共同注射到靶細胞，然后檢測編輯效果？

A:細胞系一般用質粒轉染方式遞送DNA形式基因組編輯工具、原代細胞用病毒轉導遞送DNA形式基因組編輯工具、受精卵用顯微注射方式遞送RNP形式基因組編輯工具。

 

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