1、Q:請教老師，我設計的sgRNA 與非靶序列相似度多大時會把這個非靶標基因也編輯了？是否可以理解為：在遠離pam端有4個及以內的與靶序列不同堿基的序列都是可以被編輯的。即脫靶到了那些序列。

A:有脫靶機會，但通常識別活性會比較低，一般地，脫靶是需要盡量避免的。如果想要敲除兩個以上基因，需要針對要敲除的基因分別設計crispr以制備不同的sgRNA。

2.

Q:crispr/Cas13在gRNA設計上有什么要注意的嗎？是否可以保留cas9所用的80bp骨架只更換gRNA？

A:Cas13的sgRNA與cas9的完全不同，不能使用cas9對應的sgRNA骨架。

3.

Q:sgRNA的骨架與靶點CRISPR的結合緊密程度是否會影響打靶的效率？

A:sgRNA的骨架序列并不與crispr（基因組上的特定DNA序列）結合，識別crispr序列的是102nt（20+82 nt）sgRNA中的前20 nt（gRNA序列），通過gRNA與crispr序列的互補識別，sgRNA引導Cas9靶向切割crsipr中3'側（靠近PAM即NGG）的3至4 nt間的3‘-5’磷酸二酯鍵，形成雙鏈斷裂（DSB）。

4.

Q:請問我設計人基因的sgRNA的時候，發現保守結構域所在的外顯子很少有比較高得分的，甚至說很低，請問這種情況應該怎么辦?

A:crispr評分問題，綠色沒有問題，黃色勉強能用，紅色不能用（估計是在基因組中有相同序列，1個sgRNA將識別多于1個靶向位點，脫靶問題驗嚴重），實在為難的話，可crispr設計的區域提前到前一個外顯子。另外，建議使用CCTOP軟件設計crispr

Q:我們也在使用CCTOP這個軟件，但是發現有時排名靠前的卻評分為中等或低，不知道如何選擇。

A:評分的高低只是參考，medium應該是不錯的。那個評分是來自一篇研究論文，如果閱讀原文，你會發現數據的樣本量不是太大，且相關系數不是太大。所以效率評分僅作參考。選擇crispr時，不能在基因組中存在明顯的脫靶位置的序列。

Q:那么CCTOP選擇是優先考慮排名是嗎？例如從T1-T2-T3...

A:還是優選那些脫靶機會低的crispr，（看候選脫靶序列的相似性，盡可能選那些候選脫靶序列具3個mismatch的，然后在按效率的高低選。

5.

Q:如果做RT-PCR驗證，引物是不是需要特異性針對設計sgRNA對應的轉錄本？

A:是的，需要將靶向突變位置的cDNA擴增出來，注意，由于擔心基因組上基因組序列的改變可能會影響原始mRNA的剪接，因此，設計引物時，最好是在目標序列的前面和后面的外顯子上分別設計正反向引物。

6.

Q:我做了一個CRISPR的基因敲除，目前在挑單克隆時送測了24個，亞克隆的情況多數出現兩組峰：一組是非移碼突變的，一組是有突變的（插入一個堿基或者突變成其它氨基酸），請問這種情況是我克隆沒挑夠還是基因本身的生理原因造成的?。?/span>

A:單克隆測序應該不會出現“兩組峰”！你是將細胞克隆的基因組DNA的PCR產物直接送測序？還是將其亞克隆后再挑選陽性轉化子去測序的？如果是后者，你是否想說你的陽性轉化子克隆測序結果表明：一組（若干個克?。榉且拼a突變，一組（24個克隆中的另外一些克?。┦怯型蛔兊模ú迦胍粋€堿基）？

Q:是的，是亞克隆測序，一組為非移碼突變，一組為突變。我送了十個單克隆出去測TA都是這個樣子，我想說，能不能把之前的sgRNA的病毒再感染一下這些單克隆，可否拿到雙槍的結果？

A:?你首先需要確認原先的sgRNA識別的序列在候選細胞克隆的基因組序列中是否已被突變？如果已經突變了，則sgRNA無法再次發揮左右（一般地，如果已經發生突變即使是非移碼突變，其crispr序列應該已經突變）。

7.

Q:我想請問下sgRNA設計中，有些網站把PAM序列也弄到sgRNA里了，有些網站又沒有，那我們設計sgRNA的時候需要把PAM也加進去嗎？

A:常用CRISPR設計軟件

1、http://crispr.mit.edu

2、http://crispr.cos.uniheidelberg.de/index.html

3、http://crispor.tefor.net/

4、http://www.rgenome.net/cas-designer/

5、http://zifit.partners.org/ZiFiT/

這里需要區別兩個名詞：CRISPR vs sgRNA；一些文獻常將這兩個詞混用（我們最初的培訓講義也是混用的）。實際上，sgRNA是RNA形式的分子。在基因組編輯中，sgRNA引導Cas9靶向識別CRISPR序列，其中的PAM（CRISPR序列臨近的3個核苷酸NGG為PAM）作為CRISPR序列在基因組上的一個標記，對于靶向識別至關重要，靶向識別的結果是Cas9的兩個核酸內切酶結構域(兩把”分子剪刀“)將PAM前的3-4核苷酸間的3'-5’磷酸二酯鍵切斷，造成DSB（雙鏈斷裂）。DSB出現后，誘發細胞針對該DSB進行NHEJ或HR修復，產生不同編輯子。篩選不同的編輯子，有希望獲得KO或KI的等位基因。從上述描述可以看出，CRISPR序列是一個DNA序列（不包括PAM），而由此合成的sgRNA則是用來識別該DNA序列的。張鋒把CRISPR + PAM 序列稱作Guide 序列，我們在講課中使用這一說法。在使用軟件設計CRISPR序列時，需要將目標DNA序列（包括假定的PAM序列）都輸入，如果沒有PAM，就不可能設計出CRISPR序列。

Q:那還有一個問題老師，我想請問下軟件里設計的sgRNA會不會有的是反義鏈上的序列呢，如果有的話我們需要把它互補配對回來再加CACC(g)嗎？是否只需要直接在給出的序列前面加CACC（g)就行？

A:加什么序列取決于你使用的驅動sgRNA表達的空載體中啟動子的序列，CACC應該是人U6啟動子的最后4個核苷酸序列。

8.

Q:用T7啟動子資料說轉錄起始位點是G或A ，但是ZiFiT網站是GG，是不是三個都可以，要是20個核苷酸的CRISPR序列首位不是這三個G, A或者GG, 自己手動添加到里面是不是也可以？

A:CRISPR序列一般以G開頭，這是由于轉錄自嘌呤（主要是G，有時為A)開始（是為轉錄起始位點）。如果crispr（20nt）序列的前2 nt是GG，在以T7啟動子（前17 nt)為驅動的體外轉錄中，當然是最好，如果crispr（20 nt)不是以G開頭，可以加1-2個G（一般加1個G即可），多了1-2G的sgRNA被證明不影響引導常用Cas9（spCas9）識別crispr序列的活性，但不能有效引導espCas9（保真版Cas9）識別crispr序列。

9.

Q:如果U6啟動子啟動轉錄多了一部分序列會對sgRNA的轉錄及效率產生影響嗎？就是：U6+一小段序列+BbsI-sgRNA-BbsI這樣的設計，這一小段序列對整個結構的影響很大嗎？

A:轉錄本身可能沒有什么問題，但轉錄產物不是你原來設計的sgRNA。最近有報道說多出來幾個nt可能對引導spCas9識別crispr序列影響不大，但是你提出的這種設計方式顯然不是推薦的方式，其結果是很可能不能獲得你期待的基因組編輯作用?。

Q:看測序結果的時候我們應該看哪里，理想中的是在設計的三個sgRNA的位點出突變嗎？還是在某個sgRNA附近突變也可以。

A:DSB一般出現在PAM前的3-4bp之間。NHEJ修復在此發生，因此，Indel突變（插入缺失突變）主要發生在位置的附近，當然也會有較大（甚至更大）片段刪除的情況出現。每個crispr位置都可能出現突變（如果對應的sgRNA都有活性的話）。但當有活性的sgRNA同時出現時，造成大片段刪除的機會大增。在這種情況下，常常仍能發現indel突變發生在每個crispr位置上的痕跡（即突變主要出現在PAM前的3-4bp附近）。